利用の手引き

熊本大学・遺伝子実験施設

熊本市本荘２−２−１
Tel : (096) 373-6501, FAX : (096)373-6502
２００４年　９月　２日　更新

【２】主な機器の紹介

［2.9］フローサイトメーター

設置場所：細胞分離室（605）・前室
品　　名：FACScan１台　及び　FACSCalibur １台
　　　　　ベクトン・ディッキンソン
性　　能：
　　細胞１個１個について、その大きさ（前方散乱光：FSC）と内部構造（側方散乱光：SSC）、及び 発現している抗原たんぱく質に結合した標識抗体に基づくシグナル（FL１, FL２, FL３）を検出し、 １万〜１００万細胞分のデータを統計処理して解析する装置です。FACScanは蛍光３色まで、 FACSCaliburは蛍光４色まで解析できます。デリケートな機械ですので、利用者は下記メンテナンス・ メニューを参考にして下さい。室内に置いてある"FACSCalibur Training Manual"も参考にして下さい。

利用者負担金：
　　平成１６年　９月３０日まで
　　　　　使用時間１時間につき２００円。
　　平成１６年１０月　１日から
　　　　　使用時間１時間につき５００円。

☆☆☆　FACScan　メンテナンス・メニュ−　☆☆☆

（１）FACScan　スタートアップ手順

  1. トランスのパワーをＯＮにする。
  2. シースタンクにシース液を補充する。【ＭＡＸ＝３／４】
  3. 廃液タンクを空にした後、必要であれば漂白剤を添加する。
    【ハイター１０倍希釈液、または１％次亜塩素酸ナトリウム溶液 400 ml を入れる。】
  4. VENT VALVE をＯＦＦにする（上側にセット）。
  5. FACScan 本体の電源をＯＮにする。
  6. シースタンクに圧がかかっていることと、シースフィルターに気泡が入っていないことを確認する。
  7. プリンタの電源をＯＮにする。
  8. コンピューターの電源をＯＮにする。
  9. SIP (Sample Injection Port) から蒸留水が入った試験管を取り外す。
  10. 光学系カバーを開ける。
  11. フローセルを見ながら、中の液が全て排出されるまで流路調節つまみをDRAIN にする。
  12. 流路調節つまみを FILL に回し、フローセル内にシース液が満たされていくのを確認する。
  13. フローセル内にシース液を満たしたときに気泡が見えなくなるまでDRAINとFILLを繰り返す。 【最低３回】
  14. 光学系カバーを閉じる。
  15. 蒸留水が入った試験管を SIP にセットし、チューブサポートアームをSIT (Sample Injection Tube) の下（中央の位置）にセットする。
  16. 流路調節つまみを RUN にして、２〜３分間動かす。
  17. サンプル測定までの時間が長ければ、流路調節つまみを STAND BY にしておく。
  18. FACSComp または CELLQuest を立ち上げる。

（２）FACScan　シャットダウン手順

  1. 流路調節つまみを RUN にし、サポートアームを右又は左にした状態で、2 ml の１０％ハイターを 入れた試験管を SIP (Sample Injection Port) にセットする。
  2. サンプル流量はＨＩにし、１分間そのままで漂白剤を吸引させる。
  3. サポートアームを中央に戻して、５分間 RUN。足りなくなったら漂白剤を追加する。
  4. 漂白剤が入った試験管を外し、同時に蒸留水が入った試験管を SIPにセットする。
  5. サンプル流量はＨＩにし、１分間そのままで蒸留水を吸引させる。
  6. サポートアームを中央に戻して、５分間 RUN。足りなくなったら蒸留水を追加する。
  7. 蒸留水が 1 ml 入った試験管を SIP にセットし、流路調節つまみをSTAND BY にする。
  8. VENT VALVE をＯＮにする（下側にセット）。
  9. 廃液タンクを空にする。
  10. FACScan 本体の電源をＯＦＦにする。
  11. コンピューター及びプリンタの電源をＯＦＦにする。
  12. トランスのパワーをＯＦＦにする。

（３）ライン洗浄

  1. 流路調節つまみを "STANDBY" にし、ベントバルブスイッチを下げてシ−スタンク内の空気圧を 下げる。
  2. シ−ス液フィルタ−の上下にあるプラスチックコネクタ−を、金属製のクリップを押しながら外 す。
  3. シ−スチュ−ブ（白）とエア−チュ−ブ（青）のプラスチックコネクタ−を、金属製のクリップ を押しながらはずす。液量センサ−のプラスチックコネクタ−をつまみながら同時に引っぱって 外す。
  4. シ−スタンクを取りだし、キャップを外して、ブリ−チ（１０％キッチンハイタ−）タンクに取 付ける。
  5. ブリ−チタンクをセットし、エア−チュ−ブ（青）を、元の位置（青）に取付ける。
  6. シ−スチュ−ブ（白）を、シ−ス液フィルタ−の上側が接続されていたプラスチックコネクタ− （白）に取付ける。こうすることにより、ブリ−チ液が、シ−ス液フィルタ−をバイパスされて、 直接フロ−セルへ流れるようになる。
  7. 液量センサ−を取付ける。
  8. ベントバルブスイッチを上げてシ−スタンク内の空気圧を上げる。
  9. 流路調節つまみを "RUN" にし、サンプルインジェクションポ−トにも１０％ハイタ−をセット し、２０分間流す。
  10. 同様にしてブリ−チタンクを水タンクに替えてセットし、サンプルインジェクションポ−トにも水 をセットして、"RUN" で２０分間流す。
  11. 水タンクをシ−スタンクに替え、シ−スチュ−ブ（白）とエア−チュ−ブ（青）をそれぞれ元の位 置にセットする。シ−ス液フィルタ−をセットして最初の状態に戻す。"RUN" で５分間流す。この 後、キャリブレ−ション、測定作業または通常の終了操作を行う。

（４）キャリブレ−ション

  1. CaliBRITE ビ−ズ（実習室の冷蔵ショ−ケ−ス保存）を調製する。
    白チュ−ブ・・・シ−ス液 500 ml にビ−ズ（白）１滴添加
    Mix チュ−ブ・・・シ−ス液 1 ml にビ−ズ（白・赤・緑）各１滴添加
  2. FACSComp ソフトウェアを立ち上げる。
  3. "FACScan & FACSort Training Manual FACStation ver 1.0" のPage 3-5 から 3-17 までに従い、キャ リブレ−ションを行う。
  4. サマリ−をプリントアウトし、 "FACSComp Report" にファイルする。
  5. サンプルインジェクションポ−トに水をセットし、 "RUN" で５分間流す。この後、測定作業また は通常の終了操作を行う。

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