1998年度　教養科目
I 自然と情報　　生命科学G
−−夢の技術ＰＣＲ−−

熊本大学・遺伝子実験施設
　　助教授　　荒木　正健
熊本市本荘２−２−１
Tel : (096) 373-6501, FAX : (096)373-6502
2000年　3月31日

（３）ＰＣＲのプロトコ−ル
−−−ネオマイシン遺伝子を例として−−−

１）目的とする遺伝子を検出するための適当なプライマ−を用意する。

例；ネオマイシン遺伝子を検出するためのプライマー（濃度 100 pmol / μl に調整）

  neo-F ; 5'-AGA,GGC,TAT,TCG,GCT,ATG,AC-3'   20 mer
  neo-R ; 5'-CAC,CAT,GAT,ATT,CGG,CAA,GC-3'   20 mer

増幅される領域のサイズ；２７４ｂｐ

２）サンプルを調製する。

1. マウステールＤＮＡを、ＴＥ（ＤＮＡを溶かすためにもっとも頻繁に使用される　水溶液；10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA）で１０〜２０倍希釈する。
2. トランスジーンの有無を調べたいマウスの他に、正常なマウスのテールＤＮＡも用意する。（ネガティブコントロール）
3. 目的とする遺伝子をトランスジーンとして持っているマウス（トランスジェニックマウス）のテールＤＮＡか、その遺伝子を含むプラスミドＤＮＡなどを用意する。（ポジティブコントロール）

３）機械を準備する。

例；TaKaRa PCR Thermal Cycler MP ( ¥980,000 )

４）酵素反応を行う。

例；サンプル数が１２の場合、１本あたりのボリュームの１３倍をミックスし、19 μl づつチューブに分注し、最後にＤＮＡを添加する。必要であれば、ミネラルオイルを重層する。

		x 13
DNA	1.0 μl	---
Ampli Taq	0.1 μl	・・・1.3 μl
10 x Buffer	2.0 μl	・・・26.0 μl
10 mM dNTP	0.2 μl	・・・2.6 μl
primer Neo-F	0.2 μl	・・・2.6 μl
primer Neo-R	0.2 μl	・・・2.6 μl
H2O	16.3 μl	・・・211.9 μl
Total	20.0 μl

AmpliTaq DNA Polymerase （ABI）を用いて行う場合、10 x Buffer には 15 mM MgCl₂ が含まれている。もし、使用する酵素の10 x Buffer に MgCl₂ が含まれていない場合は、25 mM MgCl₂ 溶液などを用いて、Final 1.5 mM に調整する。

５）電気泳動を行う。

ＰＣＲ反応が終わったら、5 〜 10 μl を分取し、アガロースゲル電気泳動を行う。ＥｔＢｒは最初から入れておいても良い。

Ｍ；サイズマーカー
Ｐ；ポジコン
Ｎ；ネガコン
１〜５；サンプル

＊＊＊ポジコンのバンドと同じサイズのバンドがあるかどうかを調べる。＊＊＊

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