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リアルタイムPCR

リアルタイムPCR

機種 メーカー 導入年 設置実験室
7500 Real Time PCR System Applied Biosystems H17 502機器分析室

利用者負担金対象
定期メンテナンス対象

絶対定量、相対定量、SNPsタイピング、+/−アッセイが可能です。

※2012.4.6にソフトウェアのバージョンアップを行いました。

特徴

  • 蛍光色素として FAM™, SYBR® Green 1, VIC®, TAMRA,™ ROX™,Cy3®,Cy5®, Texas Red® Dyeが使用可能
  • 反応ボリューム10-100μlで測定
  • 96ウェルプレートもしくは0.2mlチューブを使用

仕様

  • 7500 Software v2.0.6

設備

  • 簡易操作ガイド
  • 参考資料
  • 入門ガイド

・絶対定量
・相対定量
・SNPsタイピング
・+/−アッセイ

・Standard Curve Experiments
・Relative Standard Curve and Comparative Ct Experiments
・Genotyping Experiments
・Presence/Absence Experiments

  • Adhesive Seal Applicator (シールカバーをなぞってプレートに密着させるツール) 1個
  • Splash Free Support Base (チューブスタンド) 1個
  • インクジェットプリンター(EPSON, PX-V630)への出力可 ※有料

利用に関すること

  • プレートやチューブを装置にセットするためのプレートホルダーには、プレート用とチューブ用があります。それぞれホルダーに明記してありますので、ご使用の際は、間違えないようご注意下さい。
プレート用 FOR USE WITH 96 WELL PLATES ONLY
チューブ用 FOR USE WITH 8-STRIP & INDIVIDUAL TUBES ONLY
  • <注意!>サンプルブロック汚染は、測定値に影響します。チューブの側面を汚染しないよう気をつけてください。
  • Primer Express Software v3.0は現在のPCに対応していないので使えません。

2012.6.26

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利用環境
PureDyeキャリブレーション
以下の色素のみキャリブレーションを実施しました。
・FAM
・SYBRGreen
・VIC
・TAMRA

上記以外の色素で測定される方は、キャリブレーションを実施致しますので、事前にスタッフにご連絡ください。

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解析までのステップ

解析までの準備について、簡単にまとめました。

ステップ1:ケミストリの選択

TaqManプローブアッセイ SYBR Green I PCRアッセイ
原理 レポーター色素及びクエンチャー分子で両端をラベルした配列特異的オリゴヌクレオチドプロープ(TaqManプローブ)を使用します。このTaqManプローブはPCR反応中フォーワードプライマーとリバースプライマー間のターゲット配列にアニールします。そしてそれに続く伸長反応でDNAポリメラーゼが5’エキソヌクレアーゼ活性によりTaqManプローブを分解していきます。その結果クエンチャー分子によりクエンチングされていたレポーター色素の蛍光強度が増加します。 PCR反応によって増幅された二本鎖DNAへのSYBR Green I Dyeの取り込みによりDNAの定量を行ないます。SYBR Greenアッセイでは検出ターゲットに特異的な蛍光プローブは必要としませんが、非特異的な増幅産物を検出する可能性があります。
特徴 高い特異性 一次スクリーニング的な実験。非特異的産物が増幅しないPCRプライマーを使用することが前提。

ステップ2:ケミストリに合った試薬の準備

TaqManプローブアッセイ SYBR Green I PCRアッセイ
必要なもの ターゲット遺伝子のPCRプライマー(Forword & Reverse)、ターゲット遺伝子のTaqMan Probe※、TaqMan Universal PCR Master Mix※2、サンプルcDNA ターゲット遺伝子のPCRプライマー(Forword & Reverse)、PowerSYBR Green PCR Master Mix、サンプルcDNA

※primerやprobeの検索は、Applied Biosystems社のHPからできます。
インターネットオーダーシステム

※2アプリケーションにより反応試薬が変わります。カタログなどでご確認下さい。

 

ステップ3:PCRプレートなどの準備
Real-Time PCRで使用できるプレートやキャップは、タイプが限られます。以下、Applied Biosystems製品(簡易操作ガイドより抜粋)。キャップは必ずFlatである必要があります。他社からも「Real Time PCR対応」として販売されているものがあります。

☆96-Wellプレートとキャップ
・MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate
・MicroAmp Optical Cap、8caps/strip(Flat)
・ABI PRISM Optical Adhesive Cover

☆チューブとキャップ
・0.2ml MicroAmp Optical Tubes
・0.2ml ABI Optical Tubes
・MicroAmp Optical Caps (Flat)
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2012.7.18

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